SEMINARIO 9

1.-Mencione las diferencias entre un humor benigno y uno maligno.

Tumores o neoplasias buenas, benignas:

Un tumor benigno o neoplasia, es una alteración de células que provoca un crecimiento descontrolado de éstas. Las neoplasias benignas no son cancerosas. Generalmente pueden retirarse o extirparse y, en la mayoría de los casos, no reaparecen.

Tumores malignos:

Los tumores malignos son cancerosos. Las células cancerosas pueden invadir y dañar tejidos y órganos cercanos al tumor. Las células cancerosas pueden separarse del tumor maligno y entrar al sistema linfático o al flujo sanguíneo, que es la manera en que el cáncer alcanza otras partes del cuerpo. El aspecto característico del cáncer es la capacidad de la célula de crecer rápidamente, de manera descontrolada e independiente del tejido donde comenzó.

Características	Benigno	Maligno
Diferenciación	Las células tumorales se asemejan a las células maduras originales	Las células tumorales tal vez no se asemejan a las células maduras originales
Tasa de crecimiento	Lenta; puede interrumpirse o retroceder	Rápida, autónoma; generalmente no interrumpe o retrocede
Tipo de crecimiento	Se expande y desplaza	Invade, destruye y reemplaza
Metástasis	No	Sí
Efecto en la salud	Generalmente no ocasiona la muerte	Puede ocasionar la muerte si no se diagnostica y suministra tratamiento

Existen rasgos morfológicos generales que definen a un tumor maligno, pero un dato aislado en un tumor determinado es de importancia relativa y deberá utilizarse con precaución.

Macroscópicamente: Los tumores benignos son bien delimitados y a menudo encapsulados; su superficie de corte es lisa y homogénea. Los tumores malignos, por el contrario, son mal delimitados, no suelen tener cápsula y su superficie de corte es irregular con áreas de necrosis y hemorragias.

Microscópicamente: Los tumores benignos reproducen la estructura de los tejidos de los que proceden y están constituidos por células semejantes a las normales, con pocas mitosis. Los tumores malignos se parecen poco al tejido del que proceden, y con frecuencia tienen núcleos gigantes o multinucleación – plemorfismo-. A falta de diferenciación se le denomina anaplasia. Las mitosis son un buen índice de malignidad, pero con muchas excepciones; en algunos tumores, como el leiomiosarcoma, el número de mitosis es un índice esencial para el diagnóstico y pronóstico del tumor. Dado que la aparición de metástasis es el dato más característico de los tumores malignos, la infiltración de vasos sanguíneos y linfáticos por donde se producen la mayoría de las metástasis es un dato inequívoco de malignidad. El diagnóstico morfológico de transformación maligna es un tumor benigno se basa en la demostración de invasión tisular o vascular y/o la existencia de metástasis.

2. Explique las bases moleculares de las siguientes características de un tumor maligno: invasión, adhesividad celular, angiogénesis, metástasis y motilidad celular.

Invasión: La invasión es la capacidad que tienen las células tumorales de infiltrar o penetrar en los tejidos normales y en los vasos sanguíneos, y de ahí empezar la metástasis.
En general los tumores malignos no respetan los límites anatómicos normales. Esta es la característica más distintiva de los tumores malignos.

Adhesividad celular:

Es el anclaje de la célula tumoral por medio de la adquisición de receptores específicos a la membrana basal y a la matriz extracelular. Estos receptores son para integrinas, MAC y cadherinas. La adhesión celular es importante principalmente en el proceso de la metástasis (migración de células tumorales a otros tejidos para su proliferación en estos).
La E-cadherina, es la molécula de adhesión que está presente en las células de los mamíferos, factor importante en la adhesión de una célula con otra. 
En las células cancerosas, la cadherina falta parcial o completamente.

Ahora, al faltar estas moléculas de adhesión (falla de la adhesión celular), se van a desprender fácilmente, esto le va a dar a la célula cancerosa la habilidad de migrar de su sitio de origen inicial y poder invadir otros órganos.
Un estudio indicó que bloquear la E-cadherina en las células cancerosas las convirtió de no invasivas en invasivas.
Las mutaciones en el gen de la E-cadherina se relacionan con neoplasias de células aisladas como son los carcinomas difusos del estómago y carcinoma lobulillar de mama.

Angiogénesis: Es un proceso fundamental en la transformación maligna del crecimiento tumoral.
El término angiogénesis, significa literalmente formación de nuevos vasos sanguíneos. En la regulación de la angiogénesis intervienen factores positivos y negativos. El factor estimulante más potente conocido es el VEGF (vascular endotelial growth factor) que se expresa en situaciones de hipoxia y ante p53 alterado, pero también hay otros factores como bFGF (factor de crecimiento fibroblástico), angiogenina, angiotrofina y TNF (factor de necrosis tumoral). Entre los factores inhibidores están la trombospondina (regulada por p53) y la angiostatina que inhibe de forma radical la proliferación endotelial in vitro.

El VEGF ha sido un centro de atención para la investigación de la angiogénesis tumoral, que es esencial para el crecimiento del tumor. Se ha comprobado que muchos tumores expresan VEGF, y que este factor tiene una función crítica en el desarrollo y mantenimiento de una red vascular tumoral, que a su vez promueve su crecimiento y la formación de metástasis. El VEGF contribuye al crecimiento tumoral de varias formas:
* El VEGF estimula la angiogénesis tumoral, permitiendo que los tumores tengan acceso al oxígeno y los nutrientes que necesitan para crecer y la metástasis.
* El VEGF desempeña una importante función en el mantenimiento del sistema vascular del tumor al evitar la apoptosis de las células inmaduras del endotelio.
* El VEGF tiene un papel en la formación de vasos linfáticos nuevos que son una vía de metástasis tumoral.
* El VEGF evita la respuesta inmunitaria normal frente a los tumores al inhibir la maduración de las células dendríticas
En ausencia de un sistema vascular, los tumores se mantienen pequeños (1-2 mm). Los tumores malignos experimentan “una activación angiogénica”, que altera el equilibrio entre los factores proangiogénicos y antiangiogénicos, normalmente aumentando la segregación de factores de crecimiento.
El hecho que los tumores también produzcan inhibidores angiogénicos resulta ser muy importante para explicar la metástasis, que es la propagación del cáncer a otras partes del cuerpo y la principal razón de las muertes relacionadas con esta enfermedad. Frecuentemente, metástasis pequeñas, microscópicas, en áreas del cuerpo alejadas del tumor primario, permanecen inactivas durante años y empiezan a crecer solo después que el tumor primario es extirpado. Esto sucede porque el tumor primario ha estado liberando inhibidores angiogénicos en el torrente sanguíneo y cuando estos inhibidores desaparecen los tumores microscópicos empiezan a crecer. Los investigadores esperan que evitando la angiogénesis ellos puedan evitar que estas metástasis microscópicas crezcan. Además, si un tumor no se ha propagado a otras áreas y ha sido tratado efectivamente con agentes antiangiogénicos es menos probable que ocurra la metástasis, debido a que hay menos vasos sanguíneos disponibles para que las células cancerosas se diseminen desde el tumor.

Metástasis: La metástasis es una compleja serie de pasos en los que las células de cáncer abandonan el sitio original del tumor y emigran a otras partes del cuerpo a través del torrente sanguíneo o del sistema linfático.
Para ello, las células malignas se separan del tumor primario y se unen a degradar las proteínas y que constituyen la matriz extracelular circundante (ECM), que separa el tumor de los tejidos adyacentes.
Al degradar las proteínas, las células cancerosas son capaces de romper el ECM y escapar. Cuando el cáncer oral metástasis, que comúnmente viajan a través del sistema linfático a los ganglios linfáticos en el cuello.
El cuerpo se resiste a la metástasis de una variedad de mecanismos a través de las acciones de una clase de proteínas conocidas como supresores de metástasis, de los cuales se conocen alrededor de una docena.
Los investigadores del cáncer el estudio de las condiciones necesarias para la metástasis del cáncer han descubierto que uno de los acontecimientos críticos requeridos es el crecimiento de una nueva red de vasos sanguíneos, llamada angiogénesis tumoral. Se ha encontrado que los inhibidores de la angiogénesis, lo que impedirá el crecimiento de las metástasis.

Motilidad celular: La tercera etapa de la invasión local es la adquisición de la capacidad migratoria de las células tumorales. El movimiento celular es generalmente direccional tanto por quimiotaxis (gradientes de moléculas solubles) como por haptctaxis (moléculas insolubles de la matriz extracelular). Existen una serie de factores de motilidad celular, secretados bien por las propias células tumorales o por células del entorno del tumor y que contribuyen de forma positiva a la motilidad celular. Es de destacar, que algunos de estos factores son a su vez factores de crecimiento, es decir que también contribuyen a la proliferación de las células durante
el proceso de invasión. Por otra parte, el proceso de migración celular implica interacciones dinámicas de las células con su sustrato, así como una reorganización dinámica del cito esqueleto de actina, donde intervienen integrinas, moléculas de matriz extracelular y una serie de proteínas intracelulares, del mismo tipo de la proteína Ras, con capacidad de unión de GTP. Algunos de los factores de motilidad contribuyen a la activación de estas proteínas, que conducen a la reorganización del cito esqueleto de actina y de la membrana celular. El resultado es un movimiento celular de tipo ameboide con extensión de pseudópodos y protusiones de la membrana plasmática necesarias para la migración celular. En conjunto, todas estas alteraciones van a contribuir a las diferentes propiedades de las células tumorales. El conocimiento de los genes y los mecanismos implicados en la adquisición del fenotipo tumoral está dando lugar al diseño de nuevas terapias anti-tumorales dirigidas a controlar específicamente los diferentes aspectos. Por ej., drogas que bloqueen la adquisición de proteínas "maduras - de Ras a través del bloqueo de su asociación a la membrana; terapias de reparación de genes supresores, como Rb o p53; inhibidores de metaloproteasas; etc.

  3.Defina: proto-oncogen y gen supresor de tumor. Discuta en qué        que genes, ocurren mutaciones de ganancia de actividad y en qué    casos ocurren mutaciones de pérdida de función, relacionados con el  cáncer.

PROTO – ONCOGEN

o   Son genes cuyos productos promueven el crecimiento y la división de la célula.

o   Codifican factores de transcripción que estimulan la expresión de otros genes, moléculas de transducción de señales que estimulan la división celular y reguladores del ciclo celular que hacen que la célula progrese a través de este ciclo.

o   En células cancerosas, uno o más de un proto – oncogén esta alterado de manera que su actividad no puede ser controlada de manera normal. Determinados cambios estructurales y/o funcionales en los proto – oncogenes contribuyen a la malignizacion de la estirpe celular, a veces eso es debido a una mutación en el proto – oncogén que resulta en un producto proteico que funciona de manera anormal.

o   Otras veces, los proto – oncogenes pueden codificar productos proteicos normales, pero los genes se sobre expresan y no pueden ser transcripcionalmente   reprimidos en el momento adecuado.

GEN SUPRESOR DEL TUMOR

o    Se encuentran en células normales y normalmente inhiben la proliferación celular excesiva.   Una mutación o una deleción de un gen supresor tumoral, aumentará la probabilidad de que se produzca un tumor.

o   En las células normales, las proteínas codificadas por los genes supresores de tumores detienen la progresión del ciclo celular en respuesta a un daño en el ADN o a señales de supresión del crecimiento provenientes del medio extracelular. Cuando los genes supresores de tumores están mutados o son inactivos, las células no pueden responder normalmente a los puntos de control del ciclo celular, o son incapaces de realizar apoptosis si el daño del ADN es demasiado importante. Esto conduce a un incremento en las mutaciones y a la incapacidad de la célula de dejar el ciclo celular cuando debería convertirse en quiescente. Cuando los dos alelos de un gen supresor son inactivos, y hay otros cambios en la célula que la mantienen creciendo y dividiéndose, las células pueden convertirse en tumor génicas. En muchos tumores, estos genes están ausentes o inactivos, por lo que no intervienen reguladores negativos de la proliferación celular, lo que contribuye a la proliferación anormal de las células tumorales.

EN QUÉ GENES, OCURREN MUTACIONES DE GANANCIA DE ACTIVIDAD

Las mutaciones de ganancia de función son aquellas en las que el alelo mutante ha adquirido nuevas propiedades.

Cuando ocurre un cambio en el ADN, lo más normal es que corrompa algún proceso normal del ser vivo. Sin embrago, existen raras ocasiones donde una mutación puede producir una nueva función al gen, generando un fenotipo nuevo. Si ese gen mantiene la función original, o si se trata de un gen duplicado, puede dar lugar a un primer paso en la evolución. Un caso es la resistencia a antibióticos desarrollada por algunas bacterias (por eso no es recomendable hacer un uso abusivo de algunos antibióticos ya que finalmente el organismo patógeno irá evolucionando y el antibiótico no le hará ningún efecto).

¿EN QUÉ CASOS OCURREN MUTACIONES DE PERDIDA DE FUNCIÓN, REALCIONADOS CON EL CANCER?

Las mutaciones suelen determinar que la función del gen en cuestión no se pueda llevar a cabo correctamente, por lo que desaparece alguna función del organismo que la presenta. Este tipo de mutaciones, las que suelen ser recesivas, se denominan mutaciones de perdida de función.

Gen BRCA1

o   Es un gen humano del tipo de los genes supresores de tumores, que regulan el ciclo celular y evitan la proliferación incontrolada.

o   La proteína BRCA1, producto de este gen, forma parte del sistema de detección y reparación de los daños del ADN.

o   Las variaciones de este gen están implicadas en algunos tipos de cáncer, especialmente el cáncer de mama tipo 1.

Proteínas RAS

o   Los productos del gen Ras están involucrados en mecanismos de señalamiento de quinasas que controlan la transcripción de los genes, los cuales regulan después el crecimiento y la diferenciación celular.

o   Las versiones defectivas de estos genes, conocidos como los oncogenes, pueden causar que una célula se divida de una manera irregular.

o   El ras mutante ha sido identificado en canceres de varios orígenes distintos, incluyendo: páncreas (90%), colon (50%), pulmón (30%), tiroides (50%), vejiga urinaria (6%), ovarios (15%), seno, piel, hígado, riñón, y algunas leucemias.

Proteínas BCL – 2

o   Son asociadas con las membranas y su actividad.

o   La proteína BCL – 2 es una parte de un sistema complejo de señalamiento que controla la apoptosis.

o   Si los controles de apoptosis sin irrumpidos, entonces los medicamentos que trabajan para inducir la apoptosis ya no sirven tan efectivamente.

4. Mencione 2 oncogenes y 2 genes supresores de tumores y los cánceres a los que se les ha asociado.

ONCOGÉN

Protooncogenes-oncogenes: Los protoooncogenes son genes incluidos en el genoma humano que regulan el crecimiento y la diferenciación celular. Sus proteínas se expresan en diferentes momentos del ciclo y son imprescindibles para su regulación. En principio, el término protooncogén puede ser confuso, ya que implica de forma errónea que estos genes existen con el único fin de expresar un fenotipo tumoral, cuando realmente su función es esencial para la regulación del ciclo celular.

Estos oncogenes originarán proteínas con expresión/función alterada que favorecerán el crecimiento y/o la invasividad tumoral.

GEN SUPRESOR DE TUMORES

Genes supresores de tumor Los genes supresores de tumores controlan el ciclo celular evitando el crecimiento excesivo. Inhiben el crecimiento celular en condiciones normales. Cuando se produce una mutación en estos genes, sus proteínas no se expresan o dan lugar a proteínas no funcionales, favoreciendo la aparición del proceso de carcinogénesis, al no existir un control de la proliferación celular. Para que estos genes supresores adquieran su capacidad oncogénica, necesitan sufrir mutaciones independientes en ambos alelos, de manera que pierdan completamente su capacidad funcional. Como consecuencia, el crecimiento celular queda sin regulación, produciéndose una proliferación descontrolada que puede conducir a la formación de tumores. Es decir, la alteración se manifiesta con carácter recesivo. También puede ser heredada esta alteración en la línea germinal, lo que explicaría el carácter hereditario de determinados tumores, cuya frecuencia es elevada en una misma familia. En este caso, uno de los alelos ya se hereda alterado, por lo que sólo se necesita una mutación en el otro alelo, para que se manifieste la enfermedad (sensibilidad familiar). Los mecanismos por los cuales se puede alterar la expresión de los genes supresores son similares a los descritos para los protooncogenes.

Son numerosos los genes onco-supresores estudiados, entre los más conocidos tenemos p53, retinoblastoma (RB), DCC, MCC, APC, NF1, NF2 y WT-1.

Retinoblastoma: RB1

El retinoblastoma es el prototipo de las enfermedades debidas a la mutación en un gen de supresión tumoral; es un tumor infrecuente que se origina en la retinade los lactantes y que tiene una incidencia de aproximadamente 1/20.000 recién nacidos.

Puede ser hereditario en el 40% de los casos; estos niños heredan un alelo mutante (primer evento o hit) en el locus retinoblastoma (RB1) a través de las células germinales. Una mutación somática o cualquier otra alteración en una única célula de la retina da lugar a la pérdida de la función del alelo normal restante, lo que inicia el desarrollo de un tumor. Este trastorno se hereda de manera dominante debido a la presencia de un elevado número de retinoblastos primordiales y su rápida tasa de proliferación, lo cual hace que sea muy probable que se produzca una mutación somática (segundo hit) en uno o más de los retinoblastos existentes. 

Síndrome de Li-Fraumeni: TP53

Hay “cánceres familiares” infrecuentes en los que existe una historia de muchas formas diferentes de cáncer, con afectación de diversos familiares a edades tempranas, y con transmisión hereditaria mediante un patrón autosómico dominante. Este fenotipo de gran variabilidad recibe el nombre de síndrome de Li-Fraumeni (LFS, Li-Fraumenisyndrome). Se ha comprobado que los miembros afectados de las familias con LFS son portadores de una forma mutante del gen TP53 en forma de una mutación en las células germinales. Dado que el gen TP53 queda inactivado en las formas esporádicas de muchos de los cánceres que aparecen en el LFS, se considera que es un candidato al gen defectuoso causante del LFS.

Este gen codifica la proteína p53 que es una proteína de unión al ADN y es un componente importante de la respuesta celular frente a la lesión del propio ADN. Además es un factor de transcripción que activa la trascripción de genes que interrumpen la división celular y que facilitan la reparación de las alteraciones del ADN

SEMINARIO 10

1.Explique la técnica PCR (Reacción en cadena de polimerasa). Aplicaciones en medicina.

La molécula de ADN es una estructura constituida por dos cadenas que codifican la información genética de un organismo. Cada cadena es una secuencia de nucleótidos. La lectura de esta secuencia de nucleótidos proporciona la información genética propia del organismo. Con la técnica de la PCR (PolymeraseChainReaction= reacción en cadena de la polimerasa) es posible obtener millones de copias de un fragmento del ADN (por ejemplo, de un gen de interés). La proteína que lleva a cabo el proceso de copia de las cadenas del ADN es la ADN polimerasa. En el primer ciclo de la PCR se consigue duplicar el fragmento de interés porque cada cadena del ADN sirve de molde para la síntesis de otra cadena. Como en cada ciclo aumenta el número de cadenas que sirven de molde para la ADN polimerasa, en tan sólo 25 ciclos de copia la técnica de la PCR permite obtener millones de copias de un fragmento que se encontrara presente como copia única al comenzar el proceso. La PCR es una técnica válida para diferentes aplicaciones médicas que requieran una concentración alta de un fragmento concreto del ADN: para identificar anomalías en la secuencia de nucleótidos que apunten a posibles patologías, para identificar a un individuo o averiguar su parentesco con otros ya que el patrón de nucleótidos del ADN es característico de cada individuo o para detectar la presencia de ADN de microorganismos útil en el diagnóstico de infecciones o para probar la eficacia de un tratamiento.

2.- Explique la técnica de ELISA (Enzyme- LinkedInmunoSorbentAssay) directo y sus aplicaciones.

El método ELISA, se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte o pocillo (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar, la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

ELIZA directo:

El método directo permite la detección del antígeno con un anticuerpo específico conjugado con una enzima como sistema de marcaje. Consta de las siguientes etapas:

•     Fijación del soporte insoluble de antígenos específicos.
•     Adición de anticuerpos marcados con una enzima.
•     Adición de un sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. 
•     Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

APLICACIONES

•     Es una herramienta útil para determinar las concentraciones de anticuerpos en suero.
•     Se utiliza en toxicología como una pantalla preliminar con rapidez.
•     La detección de anticuerpos en Mycobacterium tuberculosis.
•     La detección de marcadores de hepatitis B en el suero. 

3.  Explique la técnica de ELISA (Enzyme-LinkedInmunoSorbentAssay) indirecto y sus aplicaciones en medicina. 

El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran variedad de antígenos; por eso es un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por tener un eslabón más con respecto al método directo. La dilución de la solución que contiene el anticuerpo primario —por ejemplo, suero sanguíneo— es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparición de falsos negativos, ya que si la muestra está muy diluida, no saldrá positiva si la titulación de anticuerpos es muy baja. (Es decir, aunque los anticuerpos están presentes, la prueba no da positivo porque la concentración de anticuerpos específicos contra el antígeno que está pegado en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una señal detectable.).

El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia de anticuerpos séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según esta técnica, proteínas recombinantes de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos contra epítopos en estas proteínas víricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.

 4. Explique la técnica de microarrays y sus aplicaciones en medicina.

Microarrays es una hibridación de una muestra de ácido nucleico ( de destino ) a una muy gran conjunto de oligonucleótidos sondas , que están unidos a un soporte sólido, para determinar la secuencia o para detectar variaciones en una secuencia de genes o la expresión o para el mapeo de genes 

La técnica de microarrays es un formato experimental, basado en la síntesis o fijación de sondas, que representan los genes (o proteínas, o metabolitos), sobre un sustrato sólido (cristal, plástico, sílice, etc.), y expuestos a las molé-culas diana (la muestra).

El análisis de microarrays implica romper una célula abierta, aislar su contenido genético, la identificación de todos los genes que están activados en esa célula en particular, y la generación de una lista de esos genes.

Micorarray ADN permite a los científicos para llevar a cabo un experimento en miles de genes al mismo tiempo.

1. Cada punto en un microarray contiene múltiples hebras idénticas de ADN.
2. La secuencia de ADN en cada lugar es única.
3. Cada punto representa un gen.
4. Miles de puntos están dispuestos en filas y columnas ordenadas en una superficie sólida (por  lo general vidrio).
5. La ubicación exacta y la secuencia de cada punto se registra en una base de datos informática.
6. Microarrays pueden ser del tamaño de un portaobjetos de microscopio, o incluso más pequeño.

Aplicaciones de los microarrays en medicina

·     Los microarrays se han aplicado al estudio de casi cualquier tipo de problema biológico.

·     El número de publicaciones anuales con la palabra microarray en el título es muy alto y continúa creciendo.

      Estudio de genes que se expresan diferencialmente entre varias condiciones Sanos/enfermos, mutantes/salvajes, tratados/no tratados.

·    Clasificación molecular en enfermedades complejas.

·    Detección de mutaciones y polimorfismos de un único gen (SNP).

     Identificación de genes característicos de una patología.

·    Predicción de respuesta a un tratamiento.

5. Marcadores celulares: proteína verde fluorescente.

La  proteína verde fluorescente (GFP; del inglés Green FluorescentProtein) es la responsable natural de las propiedades bioluminiscentes de la medusa Aequorea victoria. En esta medusa, la GFP convierte las señales luminiscentes de otra proteína, la aecuorina,  en la luminiscencia verde característica de esta especie.La GFP es una proteína monomérica de unos 230 aminoácidos que forma una estructura terciaria conocida como barril beta, común en muchas otras proteínas fluorescentes caracterizadas posteriormente. En esta proteína, el barril beta está formado por 11 cadenas e incluye una hélice alfa central que atraviesa el barril en toda su longitud. En esta hélice hay tres aminoácidos consecutivos que forman un cromóforo natural, de forma que cuando la GFP es iluminada con luz ultravioleta, produce una brillante fluorescencia verde.

El interés de la GFP desde el punto de vista biotecnológico reside en que esta proteína se comporta como una señal luminosa capaz de expresarse en células mediante las técnicas rutinarias de transgénesis. Al llevar la fluorescencia incorporada en su estructura, la bioluminiscencia de la GFP puede producirse y mantenerse espontáneamente en aquellas células vivas que incluyan el gen que la codifica, sin necesidad de añadir otros agentes o cromóforos. Su código genético puede fusionarse a otras proteínas, proporcionando a éstas un dominio fluorescente extra a modo de marca o etiqueta luminosa, que sirve para poder seguir su actividad in vivo, seleccionar y aislar aquellas células que producen la proteína fusionada a GFP o cuantificar la cantidad de dicha proteína producida en un momento dado.

SEMINARIO 11

1. Defina genómica estructural y funcional.

GENÓMICA ESTRUCTURAL

La genómica estructral se ocupa de la organización y de la secuencia de la información genética contenida en un genoma. A menudo, uno de los primeros pasos para caracterizar un genoma es preparar mapas genéticos y físicos de sus cromosomas. Estos mapas aportan información sobre la ubicación relativa de los genes, los marcadores moleculares y los segmentos cromosómicos, que suelen ser esenciales para ubicar segmentos de los cromosomas y alinear partes del DNA secuenciado para formar el genoma completo.

GENÒMICA FUNCIONAL

La Genómica funcional se ocupa de describir la función biológica de los genes mediante el conocimiento de su actividad en:

• Los rasgos que determinan.
• La regulación a la que se ven sometidos.
• La interacción con otros genes.
• La identificación de un patrón de comportamiento en un gen, dependiendo de las condiciones que le circundan.
• La actividad que desarrolla el gen cuando está alterado en relación a su actividad normal.
• La genómica funcional permite conocer con mayor detalle las funciones biológicas de la totalidad del genoma mediante el procesamiento de alto rendimiento del análisis de la expresión de manera automatizada
• Enfoque basados en secuencias

2. El gen que codifica la calcitonina en la tiroides y a la proteína relacionada con la calcitonina en el cerebro (CGRP) es el mismo. ¿Cómo es posible que un mismo gen pueda codificar estas 2 proteínas diferentes? (emplee el siguiente dibujo para su análisis)

Vias de procesamiento alternativo

Otro  hallazgo que implica la visión de un gen como una  secuencia de nucleótidos que especifica la secuencia de aminoácidos de una proteína es la existencia de las vías de procesamiento alternativo, en las que una única molécula de pre-mRNA se procesa de diferente forma para producir tipos alternativos de m RNA que conducen a la producción de diferentes proteínas a partir de una  misma secuencia e DNA

Un tipo de procesamiento alternativo es el cote y empalme alternativo en el cual la misma pre-m RNA   puede cortase  y empalmarse de más de una manera para dar como resultado múltiple m RNA que se traducen a proteínas con diferentes secuencias de aminoácidos.

En el ejemplo  se observa que el gen de la calcitonina de los  mamíferos, el cual contiene seis exones y cinco intrones. La totalidad del gen se transcribe  a un pre-m RNA. Hay dos sitios de corte 3’ posibles. En las células de la glándula tiroides, el corte en 3’ y la poliadenilacion se producen después del cuarto exón, y los primeros tres intrones, por lo tanto, se eliminan para producir un m RNA  maduro formado por exones 1, 2, 3 y 4. Este m RNA se traduce a la hormona calcitonina. En las células del cerebro, un pre-m RNA idéntico se transcribe a partir de DNA pero se procesa en forma distinta. El corte y la poliadenilacion ocurren después del sexto exón, lo que da como producto  un transcrito inicial que incluye los seis exones. durante el corte y empalme, el exón 4 (parte del m RNA de calcitonina) se elimina junto con todos los intrones; de modo tal que en la molécula madura de m RNA solo están presentes los exones 1, 2, 3, 5 y 6. Al ser traducido, este m RNA produce una proteína llamada péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), que tiene una secuencia de aminoácidos bastante distina a la de la calcitonina

Importante:El corte y empalme alternativo puede producir combinaciones distintas de los exones de un m RNA, pero el orden de estos exones, por lo general, se mantiene sin cambios. Diferentes vías de procesamiento contribuyen a la regulación de los genes.

El secuenciamiento completo de los genomas de un número de organismos ha llevado a la conclusión  de que el número de genes procesados por un organismo no se relaciona con la complejidad de este.

3.- Una enzima presente en el hígado de rata tiene una cadena polipeptídica de 452 aminoácidos y esta codificada por un gen de 1896 pares de bases. Interpretar la relación existente entre el número de residuos de aminoácidos de la proteína y el número de pares de bases del gen. 

Como sabemos el código genético está formado por tripletes de bases nitrogenadas (A; U; C; G) que a partir de estas se forma los 20 aminoácidos esenciales para la vida.

Cada codón codifica a un aminoácido en específico dependiendo de su conformación. En este caso como tenemos solo 1896 pares de base, estos van a formar un total de 632 codones, es decir habrá un total de 632 aminoácidos siendo codificados. Sin embargo tenemos que la cadena polipeptídica solo está formada por 452 aminoácidos. Lo que sucedería con el resto de aminoácidos residuales resulta en un agrupamiento que deriva en una mutación silenciosa que no afectara a la proteína porque su hidrofilidad o fobidad se mantiene por una sustitución equivalente de aminoácidos.

4. La Hb de las células falciformes tiene un residuo Val en la posición 6 de la cadena de globina, en vez de un residuo de Glu encontrado en la Hb A normal ¿Qué cambio se produce en el codón que codifica para el aminoácido en cuestión?

La hemoglobina (Hb) es una hemoproteína de la sangre de color rojo característico, que transporta el oxígeno desde los órganos respiratorios hasta los tejidos, el dióxido de carbono desde los tejidos hasta los pulmones que lo eliminan y además participa en la regulación de pH de la sangre. Dentro de este informe observaremos el caso de la Hb en células falciforme donde se pueden presentar algunas alteraciones en comparación a la Hb A o normal siendo la Hb A llamada también hemoglobina del adulto o hemoglobina normal, que representa aproximadamente el 97% de la hemoglobina sintetizada en el adulto, formada por dos globinas alfa y dos globinas beta. La alteración en la hemoglobina S es debido a la alteración del gen que codifica a la cadena β de la hemoglobina. De las cuatro cadenas polipeptídicas que forman la hemoglobina (dos alfa y dos beta), las alfa son idénticas a las de la hemoglobina normal, pero existe una alteración en las cadenas beta. Éstas tienen un aminoácido ácido glutámico en el lugar que normalmente ocupa una valina en el puesto (aminoácido) número 6 (β6 Glu→Val). El intercambio es consecuencia de una mutación puntual en la mencionada posición 6 Una de las consecuencias de estas alteraciones se da cuando existe en gran cantidad la hemoglobina falciforme (S), ocasiona que los glóbulos rojos pueden perder su forma redondeada, quedándose alargados, finos y rígidos, e inclusive lo que se conoce anemia falciforme. Finalmente lo que se busca en este informe es el reconocimiento de ambos tipos de hemoglobina y el efecto en el codón que se emplea para el momento de la codificación

5. Mediante que mecanismo se explica que la apolipoproteína B (Apo-B) en el hígado no tenga el mismo tamaño que la apolipoproteína B en el intestino.

Una apolipoproteína es una proteína que contiene y transporta lípidos en la sangre. Se trata de una heteroproteínaanfipática con un grupo prostético lipídico oteínasignifca que es la parte fundamental y proteica de las lipoproteínas, pero no se debe confundir la apolipoproteína con la apoproteína de la misma, que es la parte proteica. Dado su carácter anfipático, se encuentra junto a fosfolípidos formando la envoltura de las lipoproteínas, las cuales son estructuras macromoleculares solubles en cuyo interior hay un núcleo de grasas (triglicéridos y colesterol) Gracias a este fenomeno estructural (formación de lipoproteínas) y deunión con (receptores celulares), las apolipoproteínas pueden unir las lipoproteínas a receptores que activarán una función enzimática, la cual permitirá la degradación de las grasas contenidas en la lipoproteína. Tienen un papel fundamental en el metabolismo lipídico. Existen dos formas de apo ,la B-100 y la B-48, que proceden del mismo gen. En la especie humana existe una disociación en cuanto al lugar de síntesis de estas proteínas, la B-100 se sintetiza en el hígado mientras que la B-48 lo es en intestino. En la rata, por el contrario, el hígado puede sintetizar ambas. Centrándonos en la especie humana y en el hígado, el mARN se traduce normalmente para sintetizar una proteína de 4.536 aminoácidos, la apo B-100; mientras se va sintetizando, se asocia con triglicéridos y otros lípidos por acción de la proteína microsomal transferidora de lípidos (MTP) para constituir una partícula de VDL. En intestino existe una enzima que actúa sobre aquel mARN, desaminando una citosina del codon 2.153 y dando lugar a un codon de parada, de manera que al traducirse se sintetiza una proteína de 2.152 aminoácidos, la apo B-48, con un peso molecular del 48 por ciento aproximadamente de la B-100. Análogamente a lo que ocurría en hígado, la apo B-48 se asocia con lípidos para constituir ahora un quilomicrón. La apo B-48 se encuentra únicamente en los quilomicrones y en las lipoproteínas denominadas remanentes, que son productos del catabolismo de los primeros. La apo B-100 se encuentra en VLDL y también en las lipoproteínas de densidad intermedia (IDL) y en las LDL, productos ambas del catabolismo en el plasma de las VLDL. Tanto la apo B como la MTP son esenciales para la síntesis de estas lipoproteínas: si la apo B que se sintetiza está truncada debido a una mutación y dispone de menos del 40 por ciento de la secuencia total, las lipoproteínas que se sintetizan son inestables y el paciente manifesta la enfermedad denominada hipobetalipoproteinemia, si la MTP no es funcional, no se sintetizan quilomicrones ni VLDL y el paciente manifesta la abetalipoproteinemia, muy grave en su condición homocigótica. Aparte de este relevante papel en la estructura de las lipoproteínas, la apo B-100 es el ligando del receptor LDL. El dominio de reconocimiento se sitúa en torno al aminoácido 3.360, de manera que la apo B-48 carece de esta propiedad. La estructura de la apo B-100 es flexible y el extremo C-terminal puede plegarse ocultando aquel dominio de reconocimiento; esto ocurre fisiológicamente en las VLDL pudiéndose decir que en ellas la apo B-100es inactiva, pero no en las LDL. La mutación denominada apo-B 3.500, que afecta al aminoácido de esa posición, determina que la apo B-100 esté permanentemente replegada, impidiendo también la interacción de las LDL con el receptor LDL. Esta alteración retrasa la eliminación de las LDL del plasma y produce una hipercolesterolemia (deficiencia de apo-100)