SEMINARIO 10

1.Explique la técnica PCR (Reacción en cadena de polimerasa). Aplicaciones en medicina.

La molécula de ADN es una estructura constituida por dos cadenas que codifican la información genética de un organismo. Cada cadena es una secuencia de nucleótidos. La lectura de esta secuencia de nucleótidos proporciona la información genética propia del organismo. Con la técnica de la PCR (PolymeraseChainReaction= reacción en cadena de la polimerasa) es posible obtener millones de copias de un fragmento del ADN (por ejemplo, de un gen de interés). La proteína que lleva a cabo el proceso de copia de las cadenas del ADN es la ADN polimerasa. En el primer ciclo de la PCR se consigue duplicar el fragmento de interés porque cada cadena del ADN sirve de molde para la síntesis de otra cadena. Como en cada ciclo aumenta el número de cadenas que sirven de molde para la ADN polimerasa, en tan sólo 25 ciclos de copia la técnica de la PCR permite obtener millones de copias de un fragmento que se encontrara presente como copia única al comenzar el proceso. La PCR es una técnica válida para diferentes aplicaciones médicas que requieran una concentración alta de un fragmento concreto del ADN: para identificar anomalías en la secuencia de nucleótidos que apunten a posibles patologías, para identificar a un individuo o averiguar su parentesco con otros ya que el patrón de nucleótidos del ADN es característico de cada individuo o para detectar la presencia de ADN de microorganismos útil en el diagnóstico de infecciones o para probar la eficacia de un tratamiento.

2.- Explique la técnica de ELISA (Enzyme- LinkedInmunoSorbentAssay) directo y sus aplicaciones.

El método ELISA, se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte o pocillo (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar, la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

ELIZA directo:

El método directo permite la detección del antígeno con un anticuerpo específico conjugado con una enzima como sistema de marcaje. Consta de las siguientes etapas:

•     Fijación del soporte insoluble de antígenos específicos.
•     Adición de anticuerpos marcados con una enzima.
•     Adición de un sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. 
•     Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

APLICACIONES

•     Es una herramienta útil para determinar las concentraciones de anticuerpos en suero.
•     Se utiliza en toxicología como una pantalla preliminar con rapidez.
•     La detección de anticuerpos en Mycobacterium tuberculosis.
•     La detección de marcadores de hepatitis B en el suero. 

3.  Explique la técnica de ELISA (Enzyme-LinkedInmunoSorbentAssay) indirecto y sus aplicaciones en medicina. 

El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran variedad de antígenos; por eso es un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por tener un eslabón más con respecto al método directo. La dilución de la solución que contiene el anticuerpo primario —por ejemplo, suero sanguíneo— es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparición de falsos negativos, ya que si la muestra está muy diluida, no saldrá positiva si la titulación de anticuerpos es muy baja. (Es decir, aunque los anticuerpos están presentes, la prueba no da positivo porque la concentración de anticuerpos específicos contra el antígeno que está pegado en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una señal detectable.).

El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia de anticuerpos séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según esta técnica, proteínas recombinantes de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos contra epítopos en estas proteínas víricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.

 4. Explique la técnica de microarrays y sus aplicaciones en medicina.

Microarrays es una hibridación de una muestra de ácido nucleico ( de destino ) a una muy gran conjunto de oligonucleótidos sondas , que están unidos a un soporte sólido, para determinar la secuencia o para detectar variaciones en una secuencia de genes o la expresión o para el mapeo de genes 

La técnica de microarrays es un formato experimental, basado en la síntesis o fijación de sondas, que representan los genes (o proteínas, o metabolitos), sobre un sustrato sólido (cristal, plástico, sílice, etc.), y expuestos a las molé-culas diana (la muestra).

El análisis de microarrays implica romper una célula abierta, aislar su contenido genético, la identificación de todos los genes que están activados en esa célula en particular, y la generación de una lista de esos genes.

Micorarray ADN permite a los científicos para llevar a cabo un experimento en miles de genes al mismo tiempo.

1. Cada punto en un microarray contiene múltiples hebras idénticas de ADN.
2. La secuencia de ADN en cada lugar es única.
3. Cada punto representa un gen.
4. Miles de puntos están dispuestos en filas y columnas ordenadas en una superficie sólida (por  lo general vidrio).
5. La ubicación exacta y la secuencia de cada punto se registra en una base de datos informática.
6. Microarrays pueden ser del tamaño de un portaobjetos de microscopio, o incluso más pequeño.

Aplicaciones de los microarrays en medicina

·     Los microarrays se han aplicado al estudio de casi cualquier tipo de problema biológico.

·     El número de publicaciones anuales con la palabra microarray en el título es muy alto y continúa creciendo.

      Estudio de genes que se expresan diferencialmente entre varias condiciones Sanos/enfermos, mutantes/salvajes, tratados/no tratados.

·    Clasificación molecular en enfermedades complejas.

·    Detección de mutaciones y polimorfismos de un único gen (SNP).

     Identificación de genes característicos de una patología.

·    Predicción de respuesta a un tratamiento.

5. Marcadores celulares: proteína verde fluorescente.

La  proteína verde fluorescente (GFP; del inglés Green FluorescentProtein) es la responsable natural de las propiedades bioluminiscentes de la medusa Aequorea victoria. En esta medusa, la GFP convierte las señales luminiscentes de otra proteína, la aecuorina,  en la luminiscencia verde característica de esta especie.La GFP es una proteína monomérica de unos 230 aminoácidos que forma una estructura terciaria conocida como barril beta, común en muchas otras proteínas fluorescentes caracterizadas posteriormente. En esta proteína, el barril beta está formado por 11 cadenas e incluye una hélice alfa central que atraviesa el barril en toda su longitud. En esta hélice hay tres aminoácidos consecutivos que forman un cromóforo natural, de forma que cuando la GFP es iluminada con luz ultravioleta, produce una brillante fluorescencia verde.

El interés de la GFP desde el punto de vista biotecnológico reside en que esta proteína se comporta como una señal luminosa capaz de expresarse en células mediante las técnicas rutinarias de transgénesis. Al llevar la fluorescencia incorporada en su estructura, la bioluminiscencia de la GFP puede producirse y mantenerse espontáneamente en aquellas células vivas que incluyan el gen que la codifica, sin necesidad de añadir otros agentes o cromóforos. Su código genético puede fusionarse a otras proteínas, proporcionando a éstas un dominio fluorescente extra a modo de marca o etiqueta luminosa, que sirve para poder seguir su actividad in vivo, seleccionar y aislar aquellas células que producen la proteína fusionada a GFP o cuantificar la cantidad de dicha proteína producida en un momento dado.